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水质（粪）大肠菌群快速检验纸片
分BD105Ⅰ和BD105Ⅱ两个型号，请注意选择型号。 1、适用范围 水质（粪）大肠菌群的测定纸片快速法 本标准规定了总大肠菌群、粪大肠菌群的快速测定方法。 本标准适用于地表水、生活污水、医疗机构及禽畜养殖业等其他行业排放的废水中（粪）大肠菌群的快速筛查。 本方法的检出限为20MPN/L。 2、 2、规范性引用文件 本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。HJ/T91地表水和污水监测技术规范 3、 3、术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1总大肠菌群（total coliforms） 在37℃培养，24h内能发酵乳糖酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 粪大肠菌群（fecal coliforms） 44.5℃培养，24h内能发酵乳糖产酸气的总大肠菌群，属粪行来源，称为粪大肠菌群。 4、方法原理 将一定量的乳糖、指示剂（溴甲酚紫和2，3, 5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及营养成分等吸附于一定面积的无菌滤纸上，当细菌生长繁殖时，产酸使PH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色。同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的PH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有（粪）大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应（粪）大肠菌群的浓度值。 5、试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂。 5.1市售水质总大肠菌群、粪大肠菌群测试片：10ml水样量纸片按附录A的方法进行质量鉴定，达到要求后方可使用。 5.2无菌水 用新制备的去离子水或蒸馏水，按无菌操作要求，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。 5.3硫代硫酸钠溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml 称取硫代硫酸钠10g，溶于适量蒸馏水（或去离子）中，稀释至100ml，现配。 5.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na2）溶液：ρ(C10H14N2O8Na2。 2H2O)=0.15g/ml 称取EDTA-Na2 15g,溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100ml，此溶液保质期为30d。 6 6、 仪器和设备 6.1 恒温培养箱：37℃±1℃。 6.2 恒温培养箱：44℃±0.5℃。 6.3 高压蒸汽灭菌器：121℃、101.3kpa。 6.4 冰箱：0-4℃ 6.5 移液管：1±0.01ml、10±0.1ml。 6.6 试管：φ15mm×150mm. 6.7 采样瓶：500ml。 注1：移液器、试管、采样瓶等玻璃器皿实验前要按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌20min，烘干，备用。
6 7、样品 用灭菌器具，按照HJ/T 91的规定及无菌操作的要求，采集水样400ml放入已灭菌的采样瓶中。如果是经加氯处理的废水，需在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na2）溶液（5.4）1.2ml，以消除干扰。酸性样品，需调节胖胖的PH值至7.0-8.0。 采样后2h内检测，否则，需10℃以下冷藏并6h内送检，实验室接样后，应将样品放入0-4℃冰箱并2h内测定。 注2:10mg硫代硫酸钠可保证去除水样中1.5mg余氯，硫代硫酸钠用量克根据水样实际余氯量调整。
7 8、分析步骤 8.1接种量 每个样品按三个不同的接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15张纸片。 根据水样的污染程度确定接种量，应尽可能使5个接种量最大的纸片为阳性、5个接种量最小的纸片为阴性。 清洁水样的参考接种量分别为10 ml、1 ml、0.1 ml，受污染水样参考接种量根据污染程度可接种1 ml、0.1ml、0.01 ml或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等，见下表1。 表1水样接种量参考表 接种量小于1ml时，水样应制成稀释样品后使用。接种量为0.1ml、0.01 ml时，分别制成1:10稀释样品、1:100稀释样品。其它接种量的稀释样品依次类推。 1:10稀释样品的制作方法为：吸取1ml水样，注入盛有9 ml无菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。其它稀释度的稀释样品同法制作。
8.2接种、培养 水样充分混匀，按无菌操作制作稀释水样及接种水样。 清洁水样，接种水样总量为55.5ml，10 ml水样量纸片5张，每张接种水样10ml，1 ml水样量纸片10张，其中5张各接种水样1ml，另5张各接种1:10的稀释水样1ml。受污染水样，接种3个不同稀释度的1ml稀释水样各5张。 接种水样应均匀涂布于纸片上，纸片充分侵润、吸收水样，用手轻轻压平，做好标记。 测总大肠菌群时，在37±1℃的条件下培养18-24h后观察结果；测粪大肠菌群时，在44.5±0.5℃的条件下培养18-24h后观察结果。 注3：1、检测粪大肠菌群时，纸片接种后应立即放置于44.5±0.5℃的恒温培养箱中培养，在常温下放置过久将影响检测结果的准确性。 2、纸片加入水样后，短时间内变黄或退色，表明水样存在酸性物质活氧化剂干扰，需按“7样品”一节方法去除相应干扰。
8.3结果判定 （1）纸片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。 （2）纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。 （3）纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。 （4）纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄，为阴性。 （5）纸片无变化，为阴性。 结果判断参照图片见附录B。 6 9、结果计算与表示 6.1 9.1结果计算 根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表（附录C），经下面的公司换算报告1L水中（粪）大肠菌群数： 6.2 9.2结果表示 测定结果保留二位有效数字，大于100时以科学计数法表示，结果的单位为MPN/L。平均值以几何平均计算。 7 10、 精密度和准确度 微生物检测书记为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得MPN值全部经对数（以10为底）转换后进行以下分析。 10.1精密度 6家实验室分别对有证标准样品（15600MPN/L）、低浓度（4.0×102 MPN/L）、中浓度（1.0×104 MPN/L）、高浓度（8.0×104MPN/L）实际样品的总大肠菌群进行了测定，实验室内相对标准偏差范围分别为：4.5%～7.5%、3.5%～12.4%、4.5%～6.9%、2.8%～5.8%；实验室间的相对标准偏差范围分别为：3.3%、12.6%、4.6%、1.6%；重复限为0.61、0.67、0.67、0.64；再现性限为1.09、0.81、0.66、0.69。 6家实验室分别对有证标准样品（12100MPN/L）、低浓度（1.0×102 MPN/L）、中浓度（4.0×103 MPN/L）、高浓度（5.0×104 MPN/L）实际样品的粪大肠菌群进行了测定，实验室内的相对标准偏差范围分别为：4.5%～11.3%、11.4%～31.3%、2.8%～21.5%、3.9%～13.2%；实验室间的相对标准偏差分别为5.2%、14.8%、11.9%、8.2%。重复性限为0.93、0.83、0.85、0.77；再现性限为1.28、1.44、1.35、0.89。 10.2 10.2准确性 6家实验室对总大肠菌群有证标准样品（15600MPN/L）进行测定，实验室内相对误差的范围是-5.5%~-12.8%，相当误差的最终值为-8.8%±6.0%。 6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（12100MPN/L）进行测定，实验室内相对误差的范围是-3.8%~-16.0%，相对误差的最终值为-10.3%±9.2%。 11 11、 质量保证和质量控制 11.1应使用质量鉴定合格的纸片。 11.2每批样品应用无菌水做全程序空白测定，培养后的纸片上不的有任何微生物生长，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 11.3每批样品应使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验。总大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌，阴性菌株为金黄色葡萄菌；粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌，阴性菌株为产气肠杆菌。 上述标准菌株均制成浓度为300~3000个/ml的菌悬液，分别取相应水量的菌悬液接种纸片，按“8.2接种、培养”一节的要求培养，大肠埃希氏菌应呈现阳性反应；金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 12 12、废弃处理 使用后的器皿及废弃物须用121℃高压蒸汽灭菌20min后，器皿方可清洗，废弃物作为普通垃圾处理。
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